Matériel et méthodes
Les cas 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 18 et 19 ont été soumis à une analyse cytogénétique principalement en raison d’un retard de développement et de caractéristiques dysmorphiques. Le cas 4 a été soumis pour clarification des résultats d’un autre laboratoire, le cas 10 pour infertilité, le cas 17 pour un retard de croissance et de petits membres supérieurs, et les cas 13, 14, 15 et 16 pour le syndrome de Prader-Willi. Les caryotypes GTG à bandes des chromosomes pour chacun de ces cas sont répertoriés dans le tableau 1. Les anomalies chromosomiques détectées dans les cas 1 à 4, 6 à 9 et 11 à 19 étaient d’origine dé novo. L’analyse cytogénétique des parents n’a pas pu être réalisée pour les cas 5 et 10.
La bande GTG et la FISH ont été réalisées sur des métaphases dérivées de cultures lymphocytaires à court terme stimulées par la phytohémagglutinine M, selon les techniques standard. Les sondes pour les peintures chromosomiques complètes (1, 2, 7, 8, 11, 16 et 17), SNRPN, D3S1442, D1S1615 et le télomère 11p (Tel 11p) ont été obtenues auprès d’Oncor et hybridées dans les conditions recommandées par le fournisseur. Les peintures chromosomiques complètes pour les chromosomes 9 et 20 ont été obtenues auprès de Cytocell et hybridées dans les conditions recommandées.
L’ADN des échantillons de test et de référence a été soigneusement quantifié à l’aide d’un fluorimètre avec des étalons connus. Exactement 1 μg d’ADN de test d’un patient avec un caryotype non équilibré a été marqué avec du Spectrum green-dUTP (Vysis) et 1 μg d’ADN de référence (normal) avec du Spectrum red-dUTP (Vysis) en utilisant une trousse de transcription inverse CGH de Vysis. Dix μl d’enzyme de transcription inverse (DNase et polymérase I) de cette trousse ont été utilisés pour chaque réaction de transcription inverse effectuée à 15°C pendant quatre heures. Un aliquot de chaque réaction a été chargé sur un gel d’agarose à 1% pour déterminer la taille de la sonde, la taille optimale requise étant de 300 pb à 3 kb. L’ADN de test et de référence a ensuite été précipité à l’éthanol en présence de 50 × d’ADN humain Cot-1 (pour bloquer les séquences hautement répétitives) et resuspendu dans 10 μl de tampon d’hybridation (50% formamide, 1 × SSC, 10% de sulfate de dextran) pendant la nuit à 37°C pour faciliter la resuspension.
L’hybridation a été réalisée sur des lames préparées commercialement (Vysis) contenant des métaphases. L’ADN des métaphases a été dénaturé en plongeant les lames dans du formamide à 70%, 2 × SSC à 73°C pendant cinq minutes.
Les lames ont ensuite été déshydratées dans une série d’éthanol (70%, 85% et 100%) et séchées à l’air. L’ADN de la sonde a été dénaturé à 73°C pendant cinq minutes, puis ajouté immédiatement aux lames. Les lames ont été recouvertes d’une lamelle, scellées avec du ciment caoutchouc et placées dans un récipient humide à 37°C pendant 72 heures.
Les fragments d’ADN non liés ont été éliminés par lavage dans du SSC 0,4 × / 0,3% NP-40 à 73°C pendant deux minutes et dans du SSC 2 × / 0,1% NP-40 à température ambiante pendant 30 secondes. Les lames ont ensuite été contre-colorées avec le dihydrochlorure de 4′-6-diamidino-2-phénylindole (DAPI-antifade d’Oncor).
Des images numérisées en niveaux de gris distincts de la fluorescence DAPI, Spectrum green et Spectrum red ont été acquises avec une caméra CCD couplée à un microscope Olympus BX60. Le traitement des images a été réalisé à l’aide du logiciel Cytovision 3.52 d’Applied Imaging. Les profils de ratio moyen de fluorescence verte : rouge ont été calculés pour chaque chromosome à partir de 8 à 10 métaphases. Pour chaque expérience de CGH, un contrôle interne a été effectué en inversant les sexes entre l’ADN de test et de référence. Si l’ADN de test marqué en vert est masculin (un seul chromosome X) et l’ADN de référence marqué en rouge est féminin (deux chromosomes X), nous nous attendons à un rapport de fluorescence vert à rouge (FR) sur le chromosome X cible de 0,5. Dans la situation inverse, où l’ADN de test marqué en vert est féminin et l’ADN de référence marqué en rouge est masculin, nous nous attendons à un rapport de fluorescence vert à rouge (FR) sur le chromosome X cible de 2,0. Un écart significatif par rapport à ces FR théoriques indique une mauvaise expérience de CGH.
Les anomalies sur le chromosome X peuvent encore être observées en utilisant les valeurs de FR de 0,5 ou de 2,0 comme références.
