Le premier pas de l’édition génétique CRISPR/Cas9 consiste à concevoir un ARN guide unique (sgARN) pour cibler le gène d’intérêt. Étant donné que les sgARN sont responsables de recruter Cas9 à des loci génomiques spécifiques, une conception optimale des sgARN est cruciale pour des expériences d’édition génique réussies. Il existe de nombreux outils en ligne disponibles pour la conception des sgARN, chacun ayant des caractéristiques et avantages différents. Les informations fournies ici vous aideront à choisir le meilleur outil pour votre objectif de recherche spécifique.
Plusieurs outils en ligne disponibles
Les outils de conception de sgARN basés sur le web nécessitent généralement que les utilisateurs saisissent une séquence d’ADN, un emplacement génomique ou le nom d’un gène pour chaque gène d’intérêt, et indiquent une espèce. Un algorithme spécifique à chaque outil génère une liste de séquences guides candidates avec les sites hors-cible prédits correspondants pour chaque entrée (Wu et al. 2014). La plupart des outils visent à fournir des séquences guides qui minimisent la probabilité d’effets hors-cible, mais les méthodes qu’ils utilisent varient. Par exemple, Chop Chop utilise des données empiriques provenant de plusieurs publications récentes (par exemple Doench et al. 2016) pour calculer des scores d’efficacité. En revanche, CasFinder (Aach et al. 2014) et E-CRISP (Heigwer et al. 2014) intègrent des pénalités spécifiques définies par l’utilisateur en fonction du nombre et de la position des mésappariements par rapport à la séquence guide afin de classer le potentiel d’effets hors-cible.
Outils pour des applications spécifiques
Certains outils de conception de sgARN ont été développés pour des applications spécifiques. CRISPR-ERA (Liu et al. 2015) est le seul outil actuellement disponible qui conçoit des sgARN spécifiquement pour la répression ou l’activation des gènes, tandis que FlyCRISPR (Gratz et al. 2013) se concentre sur les applications chez les mouches, les coléoptères et les vers, y compris les organismes modèles populaires tels que Drosophila melanogaster et Caenorhabditis elegans. Actuellement, l’outil de conception présenté sur le site web Benchling est le seul capable de générer des sgARN candidats compatibles avec des nucléases alternatives telles que Staphylococcus aureus Cas9 (Ran et al. 2015) et Cpf1 (Zetsche et al. 2015). Étant donné l’unicité de chaque outil, nous vous recommandons d’utiliser plusieurs approches lors du processus de conception des sgARN et de choisir des séquences guides qui sont prédites de manière cohérente pour bien fonctionner.
Une sélection d’outils gratuits
Le tableau ci-dessous fournit une liste d’outils en ligne pour la conception des sgARN. Pour plus de simplicité, nous n’avons inclus que ceux qui sont gratuits et ne nécessitent pas d’abonnement. Pour chaque outil, nous avons indiqué s’il dispose d’une interface utilisateur graphique pratique ou si l’utilisateur doit télécharger un script. Si vous préférez concevoir des sgARN manuellement, veuillez consulter l’article sur le choix d’une séquence cible pour l’édition génique CRISPR/Cas9 afin d’en savoir plus.
Références:
- Aach, et al. Flexible algorithm for identifying specific Cas9 targets in genomes. BioRxiv, Cold Spring Harbor Labs. doi: http://dx.doi.org/10.1101/005074 (2014).
- Bae, et al. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30(10):1473-1475 (2014).
- Doench, J. G. et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nat Biotech 34, 184-191 (2016).
- Gratz, et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genetics. 196(4):961-971 (2014).
- Heigwer, et al. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nat Methods. 11(2):122-123 (2014).
- Montague, et al. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Res. 42(W1):W401-W407 (2014).
- Liu, et al. CRISPR-ERA: a comprehensive design tool for CRISPR-mediated gene editing, repression and activation. Bioinformatics. 31(22):3676-3678 (2015).
- Ran, et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520(7546):186-191 (2015).
- Wu, et al. Target specificity of the CRISPR-Cas9 system. Quant Biol. 2(2):59-70 (2015).
- Zetsche, et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System. Cell. 163(3):759-771 (2015).
