La conception d’un ARN guide pour Cas9 peut sembler délicat, voire intimidant, mais l’utilisation d’outils de conception peut vous aider. Un bon outil de conception utilise des règles prédéterminées optimisées pour maximiser l’édition sur la cible tout en vérifiant (et minimisant) les effets hors cible, à partir de données expérimentales et bioinformatiques.
Dans les premiers jours de CRISPR, plusieurs laboratoires ont généreusement mis en ligne des outils de conception d’ARN guides. Certains de ces outils académiques sont toujours disponibles, mais leur durabilité et leur fiabilité varient. Heureusement, des outils de conception d’ARN guides CRISPR gratuits sont disponibles sur le site web d’IDT. Ces outils IDT sont continuellement améliorés et mis à jour à mesure que la science avance dans la prédiction de l’activité sur la cible et hors cible. Dans cet article, nous couvrons les sections suivantes :
Comment fonctionne notre outil de conception d’ARN guides Cas9?
L’outil de conception d’ARN guides personnalisés Alt-R™ CRISPR-Cas9 d’IDT peut vous aider à concevoir des séquences d’ARN guides pour une utilisation avec Cas9, présentant une activité sur la cible élevée et une activité hors cible faible chez l’homme, la souris, le rat, le poisson-zèbre et le C. elegans, pour votre application de recherche spécifique. Cet outil de conception d’ARN guide est basé sur un modèle sur la cible, construit à l’aide de l’apprentissage automatique, pour prédire si une conception d’ARN guide fonctionnera. Le modèle a été entraîné pour prédire l’efficacité de l’édition par Cas9 en utilisant plus de 1400 caractéristiques dans 560 séquences guides. Les caractéristiques prédictives comprennent la composition et la position des bases dans la séquence d’ARN guide de 20 nucléotides, ainsi que la probabilité d’auto-hybridation entre l’ARN cr et l’ARN traceur. Les notes élevées sur la cible indiquent qu’un guide est susceptible de fonctionner (la fonctionnalité étant définie par une efficacité d’édition supérieure à 40 %). Le modèle a été testé à l’aide de données d’activité d’édition pour 215 ARN guides avec des notes élevées sur la cible.
L’outil de conception d’ARN guides IDT offre 3 modes (accessibles via les onglets en haut), comme le montre la Figure 1 (ci-dessous).
ARN guides prédéfinis (le plus rapide et le plus pratique) : Une bibliothèque d’ARN guides prédéfinis pour 5 espèces est accessible en utilisant le premier onglet. Nous avons inclus des ARN guides CRISPR-Cas9 (tels que les ARN cr et les ARN sg) ciblant les gènes humains, de souris, de rat, de poisson-zèbre et de C. elegans. Il vous suffit d’entrer le symbole du gène qui vous intéresse, puis de sélectionner l’espèce sur laquelle vous travaillez et le nombre de conceptions souhaitées. L’avantage de commander des ARN cr prédéfinis est qu’ils vous permettent d’éditer le site cible avec une grande efficacité. Cependant, nous recommandons de tester 3 guides pour obtenir les meilleurs résultats.
Conceptions personnalisées : Les conceptions personnalisées d’ARN guides vous permettent de cibler n’importe quelle séquence de n’importe quelle espèce. L’outil de conception d’ARN guides personnalisés accepte les séquences cibles au format FASTA, et les ARN guides conçus peuvent être vérifiés pour une activité hors cible potentielle contre l’une des 5 espèces prises en charge. Nous recommandons de concevoir et de tester 3 guides pour trouver le meilleur guide pour votre expérience CRISPR.
Astuce : Comment utiliser le mode de conception personnalisée pour concevoir un ARN guide : Pour concevoir vos ARN guides personnalisés pour l’édition du génome Cas9, commencez par obtenir la séquence FASTA de la région que vous souhaitez éditer. Vous pouvez trouver cela en effectuant une recherche de la séquence génomique d’intérêt sur le site web du NCBI, puis en sélectionnant une partie du génome (23-1000 pb) à utiliser en tant que séquence d’entrée. Nous déconseillons de commencer par une séquence transcrite en raison du risque qu’une séquence d’ARN guide retournée chevauche un épissage, ce qui ne se produit pas dans le génome.
Dans l’outil de conception IDT, sélectionnez l’espèce souhaitée dans le menu déroulant, copiez et collez la séquence FASTA, puis cliquez sur “Concevoir”. L’outil vous renverra une liste des séquences d’ARN guide ainsi que leurs scores sur la cible et hors cible respectifs. Si le risque d’activité hors cible est trop élevé, l’outil vous mettra en garde (si vous analysez une séquence appartenant à l’une des 5 espèces mentionnées ci-dessus). L’outil vous renverra également un score sur la cible pour une séquence d’ARN guide ciblant n’importe quelle espèce, et vous préviendra si le score sur la cible est faible, indiquant un risque de faible activité. Sélectionnez un ARN guide avec les scores sur la cible et hors cible les plus élevés pour une activité optimale, pour les raisons suivantes :
- Un score élevé sur la cible est bon. Cela signifie que vous êtes susceptible d’avoir une efficacité d’édition élevée au niveau du site cible.
- Un score élevé hors cible est également bon. Cela signifie que vous ne risquez pas d’avoir de nombreux effets hors cible dans les cellules. Les effets hors cible sont ce que vous voulez éviter, donc un score élevé est bon.
Vérificateurs de conception : L’outil de vérification de conception d’ARN guides Cas9 d’IDT vous permet d’évaluer le potentiel sur la cible et hors cible des séquences d’ARN guides que vous avez conçues vous-même, ou que vous avez obtenues à partir de publications, avant de les commander. Comme pour le mode de conception personnalisée, des analyses des effets hors cible sur les gènes humains, de souris, de rat, de poisson-zèbre et de C. elegans sont disponibles, ainsi qu’une analyse sur la cible pour n’importe quelle espèce. Vous pouvez copier la séquence d’ARN guide dans l’outil IDT. La séquence doit comporter 20 bases et être directement en amont (dans le sens 5′) d’un site PAM (NGG, où N peut être n’importe quel nucléotide). Après avoir choisi une séquence d’ARN guide, l’outil vous renverra le score hors cible et sur la cible correspondant à la séquence.
Autres espèces : analyse hors cible
Si l’analyse des effets hors cible dans l’espèce d’intérêt n’est pas couverte par les outils de conception d’IDT, vous pouvez trouver d’autres outils de conception d’ARN guides actuellement disponibles en ligne, provenant de différents laboratoires de recherche académique. Nous ne pouvons pas garantir les résultats des outils de conception externes. Cependant, si vous avez des questions sur nos outils, notre équipe de support se fera un plaisir de vous aider. Envoyez-nous un e-mail à crispr@idtdna.com.
IMPORTANT ! Vous remarquerez peut-être que notre outil de commande permet des séquences cibles de 19 et 20 nucléotides pour une utilisation avec Cas9. Nos recherches ont montré que 19 nucléotides peuvent fournir une efficacité d’édition similaire à celle de 20 nucléotides, mais que 20 nucléotides est l’objectif. Lorsque vous utilisez l’enzyme de restriction Alt-R S.p. HiFi Cas9, les séquences de 20 nucléotides se sont révélées fournir la plus grande quantité d’édition génomique.
Après avoir utilisé l’un des 3 modes de l’outil, faites défiler la page pour trouver vos résultats. Un lien pratique est disponible pour commander votre ARN guide Cas9.
Comment concevoir un ARN guide pour Cas12a (Cpf1)
Instructions simples pour la conception des ARN guides :
- Regardez votre séquence d’ADN d’intérêt.
- Trouvez un site PAM (motif adjacent à la cible) proche de l’emplacement d’édition souhaité. Le site PAM est TTTV, où V peut être A, C ou G. Assurez-vous de regarder les deux brins de l’ADN, car un PAM sur l’un ou l’autre brin peut fonctionner tout aussi bien.
- Ensuite, rendez-vous sur notre page de commande. Entrez 20 à 24 bases (21 étant préférable) à l’aval du site PAM, dans le sens 5′ vers 3′, lors de la commande de votre ARN cr (Figure 2 ci-dessous). Et c’est tout !
Explication détaillée des instructions simples :
Pour les ARN cr à utiliser avec Cas12a, repérez les emplacements dans votre région cible contenant une séquence PAM, TTTV, où V est A, C ou G. Le PAM peut être sur l’un ou l’autre brin de la séquence d’ADN. Si vous utilisez Cas 12a Ultra, certains sites TTTT fonctionneront.
L’ARN cr Alt-R CRISPR-Cas12a est un ARN guide simple, de 40 à 44 bases. Il comporte une région constante de 20 bases (domaine en boucle) et une région spécifique à la cible de 20 à 24 bases (domaine d’écarteur), qui consiste en la séquence en aval du site PAM TTTV dans l’ADN cible. L’écarteur reconnaît (est complémentaire à) 21 nucléotides sur le brin qui ne contient pas le site PAM. Nous recommandons un domaine d’écarteur de 21 bases pour une activité optimale. Le site de clivage est spécifié par le domaine d’écarteur.
Après avoir identifié une séquence cible de 20 à 24 bases, vous pouvez l’entrer dans la page de commande. Ensuite, 20 bases supplémentaires et les modifications nécessaires seront automatiquement ajoutées par notre système de saisie de commande, pour un total de 40 à 44 bases d’ARN. Ces bases supplémentaires et modifications sont nécessaires pour créer un ARN cr complet Alt-R CRISPR-Cas12a (Cpf1). Le système convertit automatiquement la séquence finale en ARN, il faut donc entrer des bases d’ADN dans l’outil de commande (Figure 2), mais sans inclure le site PAM lui-même.
Petit fait amusant sur Cas 12a : Cas12a ne nécessite pas d’ARN traceur. Vous n’avez donc pas besoin de vous en préoccuper !
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