Différents systèmes, différentes règles?
Les chercheurs ont développé des règles ou des algorithmes pour prédire des propriétés spécifiques, telles que les off-targets minimaux ou l’efficacité maximale, en parallèle du développement rapide des approches basées sur CRISPR. Les développeurs de règles off-target ont pu s’inspirer des approches développées pour limiter les off-targets basés sur les séquences des réactifs d’ARNi ou garantir la spécificité des amorces. La majorité des algorithmes de prédiction des off-targets pour CRISPR sont basés sur la définition de séquences génomiques similaires à la séquence cible, puis sur l’utilisation d’une limite définie par l’utilisateur pour le nombre de bases non appariées susceptibles d’empêcher la mutation. Cependant, il n’est actuellement pas clair combien de non-appariements sont nécessaires pour empêcher la mutation d’un site off-target, et cela peut varier en fonction du système. De plus, il est possible que même les séquences off-target qui ne sont pas des correspondances parfaites, c’est-à-dire avec une discontinuité dans l’appariement des séquences créant un écart ou un renflement, puissent être des sites cibles valides. Cependant, la plupart des algorithmes actuels ne les évaluent pas. Plusieurs approches impartiales ont été développées pour détecter la coupe off-target par CRISPR, bien qu’il ne soit généralement pas possible de les appliquer à chaque ARN guide utilisé. Néanmoins, l’ampleur des off-targets, ainsi que la différence de pertinence des off-targets dans les approches comme CRISPRa et CRISPRi par rapport à la génération de knockouts médiés par la NHEJ, suggèrent que des off-targets supplémentaires et spécifiques à chaque approche restent une préoccupation. Des revues récentes pertinentes abordant les off-targets et leur détection sont disponibles (Réfs. 14, 15, 16, 17).
Certaines règles d’efficacité des ARN guide ne semblent pas toujours être généralisables pour différentes applications de Cas9, ou pour la même application dans différentes espèces. Même les groupes travaillant sur la même espèce ont identifié différents critères associés à l’efficacité, par exemple, et les rapports d’améliorations pertinentes pour une espèce (par exemple, GG en position 3′) attendent une validation ultérieure dans le même système et dans d’autres systèmes. Dans le cas de CRISPRa et CRISPRi, les chercheurs cherchent à définir des règles de conception non seulement pertinentes pour la séquence des ARN guide, mais aussi pour le nombre et la position des ARN guide par rapport aux caractéristiques annotées spécifiques du gène cible. Pour CRISPRa, deux études ont montré que l’activation est maximisée lorsque les ARN guide se trouvent dans une fenêtre de -400 à -50 pb en amont du TSS. En revanche, l’extinction par CRISPRi est rapportée comme étant la plus efficace lorsque les ARN guide ciblent de -50 à +300 pb à partir du TSS et ne ciblent pas une partie de l’ADN liée aux nucléosomes. Pour CRISPRi, les exigences semblent être différentes chez les procaryotes et les eucaryotes : bien que CRISPRi chez Escherichia coli nécessite que les ARN guide ciblent le brin non-templat (également appelé brin sens), des rapports ultérieurs sur les cellules eucaryotes ont démontré que les ARN guide se fixant à l’un ou l’autre brin peuvent fonctionner. Les chercheurs testent actuellement l’impact de la séquence des ARN guide, de leur placement par rapport aux sites de transcription ou de traduction, et de différentes formes de Cas9 ou de protéines de fusion Cas9, dans le but de trouver des paramètres optimaux pour l’activation ou l’inhibition spécifique et robuste des cibles. Les effets off-target sont probablement moins préoccupants que pour les approches de coupure CRISPR en raison de la plage limitée de sites de liaison efficaces par rapport au promoteur cible. Même si la liaison se produit au niveau de sites off-target, il est peu probable qu’elle se situe à une distance efficace d’une séquence promotrice et aura donc peu d’effet sur l’expression génique.
De manière intéressante, un ensemble récemment publié de règles de conception qui améliorent considérablement l’efficacité des ARN guide pour l’activité de coupure de Cas9 et pour CRISPRi n’a pas pu prédire l’efficacité des ARN guide pour CRISPRa. Cela suggère que des principes de conception distincts peuvent être nécessaires pour ces deux approches. De plus, étant donné que l’efficacité de CRISPRa est inversement corrélée au niveau d’expression basal d’un gène donné (c’est-à-dire que CRISPRa est plus efficace pour les gènes exprimés à faible niveau), les chercheurs doivent garder à l’esprit que même lorsqu’ils utilisent un ARN guide par ailleurs efficace pour activer un gène d’intérêt, un niveau d’expression basal élevé limitera probablement l’impact que CRISPRa peut avoir. Dans l’ensemble, il reste à voir dans quelle mesure des règles générales émergeront pour les différentes approches CRISPR, dans quelle mesure les paramètres optimaux seront spécifiques à une espèce, à un tissu ou à un type de cellule particulier, dans lesquels des facteurs endogènes pourraient être pertinents pour la spécificité et/ou l’efficacité, et dans quelle mesure les paramètres optimaux seront spécifiques à une méthode de livraison donnée (transfection, transduction, etc.) où les étapes limitantes du débit peuvent être différentes pour différentes méthodes de livraison.
