Des systèmes différents, des règles différentes?
Avec le développement rapide des approches basées sur CRISPR, les chercheurs ont élaboré des règles ou des algorithmes pour prédire des propriétés spécifiques, telles que les off-targets minimes ou l’efficacité maximale. Les développeurs de règles d’off-targets ont pu s’inspirer des approches développées pour limiter les off-targets basés sur les séquences des réactifs ARNi ou assurer la spécificité des amorces. La majorité des algorithmes de prédiction des off-targets pour CRISPR sont basés sur la définition de séquences génomiques similaires à la séquence on-target, puis sur l’utilisation d’une valeur seuil définie par l’utilisateur pour le nombre de bases non appariées qui sont susceptibles d’empêcher la mutation. Cependant, il n’est pas clair combien de non appariements sont nécessaires pour empêcher une mutation d’un site off-target, et cela peut varier en fonction du système. De plus, il est possible que même les séquences off-target qui ne sont pas des correspondances parfaites, c’est-à-dire avec une discontinuité dans la correspondance de séquence créant un espace ou une bosse, puissent être des sites cibles valides. Pourtant, la plupart des algorithmes actuels ne les évaluent pas. Plusieurs approches impartiales ont été développées pour détecter les coupures off-target de CRISPR, bien qu’il ne soit généralement pas possible de les appliquer pour chaque gRNA utilisé. Néanmoins, l’étendue des off-targets, ainsi que la différente pertinence des off-targets dans les approches telles que CRISPRa et CRISPRi par rapport à la génération de knockouts médiés par la NHEJ, suggèrent que les off-targets supplémentaires spécifiques à chaque approche restent une préoccupation ; des revues récentes pertinentes discutant des off-targets et de leur détection comprennent les références 14, 15, 16, 17.
Certaines règles d’efficacité des gRNA ne semblent pas toujours être généralisables à différentes applications de Cas9, ou à la même application dans différentes espèces. Même les groupes travaillant sur la même espèce ont identifié différents critères associés à l’efficacité, par exemple, et les rapports d’améliorations pertinentes pour une espèce (par exemple, 3′ GG, comme rapporté pour Caenorhabditis elegans) attendent une validation supplémentaire dans les mêmes systèmes et d’autres. Dans le cas de CRISPRa et CRISPRi, les chercheurs s’efforcent de définir des règles de conception non seulement pertinentes pour la séquence du gRNA, mais aussi pour le nombre et la position des gRNA par rapport à des caractéristiques annotées spécifiques du gène cible. Pour CRISPRa, deux études ont montré que l’activation est maximisée lorsque les gRNA se trouvent dans une fenêtre située de -400 à -50 pb en amont du TSS. En revanche, l’extinction CRISPRi est apparemment la plus efficace lorsque les gRNAs ciblent de -50 à +300 pb du TSS, et lorsque les gRNAs ne ciblent pas une partie de l’ADN liée par des nucléosomes. Pour CRISPRi, il semble y avoir des exigences différentes chez les procaryotes et les eucaryotes : bien que CRISPRi chez Escherichia coli nécessite que les gRNAs ciblent le brin non-template (appelé brin sens), des rapports ultérieurs dans les cellules eucaryotes ont démontré que les gRNAs qui se lient à l’un ou l’autre brin peuvent fonctionner. Les chercheurs testent actuellement simultanément l’impact de la séquence du gRNA, de l’emplacement du gRNA par rapport aux sites de transcription ou de traduction, et des protéines Cas9 ou des protéines de fusion Cas9 alternatives, dans le but de trouver des paramètres optimaux pour l’on-target et l’activation ou l’inhibition robuste. Les effets off-target sont probablement moins préoccupants que dans les approches de coupure CRISPR en raison de la gamme limitée de sites de liaison efficaces par rapport au promoteur cible. Autrement dit, même si une liaison se produit sur des sites off-target, il est peu probable qu’elle se produise à l’intérieur de la portée efficace d’une séquence promotrice et aura donc peu d’effet sur l’expression génique.
Il est intéressant de noter qu’un ensemble de règles de conception récemment publié, qui améliore considérablement l’efficacité du gRNA pour l’activité de coupure de Cas9 et pour CRISPRi, n’a pas pu prédire l’efficacité du gRNA pour CRISPRa. Cela suggère que des principes de conception distincts peuvent être nécessaires pour ces deux approches. De plus, étant donné que l’efficacité de CRISPRa est inversement corrélée au niveau d’expression basal d’un gène donné (c’est-à-dire que CRISPRa est plus efficace pour les gènes exprimés à faible niveau), les chercheurs doivent garder à l’esprit que même lors de l’utilisation d’un gRNA par ailleurs efficace pour activer un gène d’intérêt, un niveau d’expression basal élevé limitera probablement l’impact que CRISPRa peut avoir. Dans l’ensemble, il reste à voir dans quelle mesure des règles générales émergeront pour différentes approches de CRISPR, dans quelle mesure les paramètres optimaux seront spécifiques à une espèce, à un tissu ou à un type cellulaire particulier, dans lequel certains facteurs endogènes pourraient être pertinents pour la spécificité et/ou l’efficacité ; et dans quelle mesure les paramètres optimaux seront spécifiques à une méthode de livraison donnée (transfection, transduction, etc.), par exemple, car les étapes limitantes pourraient être différentes pour différentes méthodes de livraison.
