L’utilisation de CRISPR a connu un développement rapide au fil des années, et les chercheurs ont élaboré des règles et des algorithmes pour prédire certaines propriétés spécifiques, comme les risques de hors-cibles ou l’efficacité maximale. Ces règles de hors-cibles ont été empruntées aux approches déjà développées pour limiter les hors-cibles basées sur les séquences d’ARN interférents ou garantir une spécificité des amorces. La plupart des algorithmes de prédiction de hors-cibles pour CRISPR se basent sur la définition de séquences génomiques similaires à la séquence cible, et utilisent ensuite une limite définie par l’utilisateur pour le nombre de bases non appariées qui empêcheraient une mutation. Cependant, il reste encore des incertitudes quant au nombre de non appariements nécessaires pour empêcher une mutation d’un site hors-cible, et cela peut varier d’un système à l’autre. De plus, il est possible que même les séquences hors-cibles qui ne sont pas des correspondances parfaites, c’est-à-dire avec une discontinuité dans la séquence créant un écart ou une boucle, puissent être des sites cibles valides, même si la plupart des algorithmes actuels ne les évaluent pas. Plusieurs approches impartiales ont été développées pour détecter les coupures hors-cibles par CRISPR, bien qu’il ne soit généralement pas possible de les appliquer pour chaque ARN guide utilisé. Néanmoins, l’étendue des hors-cibles, ainsi que leur importance différente dans des approches telles que CRISPRa et CRISPRi par rapport à la génération de knockouts par NHEJ, suggèrent que des hors-cibles supplémentaires spécifiques à chaque approche restent une préoccupation. Des revues récentes traitant des hors-cibles et de leur détection sont disponibles pour des informations plus détaillées [^14^, ^15^, ^16^, ^17^].
Certaines règles pour l’efficacité des ARN guides ne semblent pas toujours être généralisables pour différentes applications de Cas9, ou pour la même application dans différentes espèces. Même les groupes travaillant sur la même espèce ont identifié différents critères associés à l’efficacité, et les améliorations rapportées pour une espèce (par exemple, le GG en 3′ rapporté pour Caenorhabditis elegans) attendent encore une validation plus poussée dans le même système et dans d’autres systèmes. Pour les applications de CRISPRa et CRISPRi, les chercheurs tentent de définir des règles de conception non seulement en fonction de la séquence de l’ARN guide, mais également du nombre et de la position des ARN guides par rapport aux caractéristiques spécifiques annotées du gène cible. Pour CRISPRa, deux études ont montré que l’activation est maximisée lorsque les ARN guides se trouvent dans une fenêtre de -400 à -50 pb en amont du site de démarrage de la transcription (TSS) [^19^, ^20^]. En revanche, le silence génique induit par CRISPRi semble être le plus efficace lorsque les ARN guides ciblent de -50 à +300 pb à partir du TSS, et lorsque les ARN guides ne ciblent pas une portion d’ADN liée à des nucléosomes [^19^, ^21^]. Pour CRISPRi, il semble y avoir des exigences différentes chez les procaryotes et les eucaryotes : bien que CRISPRi chez Escherichia coli nécessite que les ARN guides ciblent le brin non transcrit (aussi appelé brin sens), des études ultérieures dans les cellules eucaryotes ont montré que les ARN guides se liant à l’un ou l’autre brin peuvent fonctionner [^4^, ^23^, ^24^]. Les chercheurs testent actuellement l’impact de la séquence des ARN guides, de leur position par rapport aux sites de démarrage de la transcription ou de la traduction, et des protéines Cas9 ou des protéines de fusion Cas9 de rechange, dans le but de trouver les paramètres optimaux pour l’activation ou l’inhibition ciblée et robuste. Les effets hors-cibles sont probablement moins préoccupants que pour les approches de coupure CRISPR en raison de la gamme limitée de sites de liaison efficaces par rapport au promoteur cible. Autrement dit, même si la liaison se produit sur des sites hors-cibles, il est peu probable que cela se produise à une distance suffisamment proche du promoteur pour avoir un effet significatif sur l’expression génique.
Il est intéressant de noter qu’un ensemble récemment publié de règles de conception qui améliorent considérablement l’efficacité des ARN guides pour l’activité de coupure de Cas9 et pour CRISPRi n’a pas réussi à prédire l’efficacité des ARN guides pour CRISPRa. Cela suggère que des principes de conception distincts peuvent être nécessaires pour ces deux approches. De plus, étant donné que l’efficacité de CRISPRa est inversement corrélée au niveau d’expression basal d’un gène donné (c’est-à-dire que CRISPRa est plus efficace pour les gènes exprimés à faible niveau), les chercheurs doivent garder à l’esprit que même lors de l’utilisation d’un ARN guide par ailleurs efficace pour activer un gène d’intérêt, un niveau d’expression basal élevé limitera probablement l’impact que CRISPRa peut avoir. Dans l’ensemble, il reste à voir dans quelle mesure des règles générales émergeront pour les différentes approches de CRISPR, dans quelle mesure les paramètres optimaux seront spécifiques à une espèce, à un tissu ou à un type cellulaire particulier, dans lesquels des facteurs endogènes pourraient être pertinents pour la spécificité et/ou l’efficacité, et dans quelle mesure les paramètres optimaux seront spécifiques à une méthode de délivrance donnée (transfection, transduction, etc.), par exemple, car les étapes limitantes de vitesse pourraient être différentes pour différentes méthodes de délivrance.
L’utilisation de CRISPR a connu un développement rapide au fil des années, et les chercheurs ont élaboré des règles et des algorithmes pour prédire certaines propriétés spécifiques, comme les risques de hors-cibles ou l’efficacité maximale. Ces règles de hors-cibles ont été empruntées aux approches déjà développées pour limiter les hors-cibles basées sur les séquences d’ARN interférents ou garantir une spécificité des amorces. La plupart des algorithmes de prédiction de hors-cibles pour CRISPR se basent sur la définition de séquences génomiques similaires à la séquence cible, et utilisent ensuite une limite définie par l’utilisateur pour le nombre de bases non appariées qui empêcheraient une mutation. Cependant, il reste encore des incertitudes quant au nombre de non appariements nécessaires pour empêcher une mutation d’un site hors-cible, et cela peut varier d’un système à l’autre. De plus, il est possible que même les séquences hors-cibles qui ne sont pas des correspondances parfaites, c’est-à-dire avec une discontinuité dans la séquence créant un écart ou une boucle, puissent être des sites cibles valides, même si la plupart des algorithmes actuels ne les évaluent pas. Plusieurs approches impartiales ont été développées pour détecter les coupures hors-cibles par CRISPR, bien qu’il ne soit généralement pas possible de les appliquer pour chaque ARN guide utilisé. Néanmoins, l’étendue des hors-cibles, ainsi que leur importance différente dans des approches telles que CRISPRa et CRISPRi par rapport à la génération de knockouts par NHEJ, suggèrent que des hors-cibles supplémentaires spécifiques à chaque approche restent une préoccupation. Des revues récentes traitant des hors-cibles et de leur détection sont disponibles pour des informations plus détaillées [^14^, ^15^, ^16^, ^17^].
Certaines règles pour l’efficacité des ARN guides ne semblent pas toujours être généralisables pour différentes applications de Cas9, ou pour la même application dans différentes espèces. Même les groupes travaillant sur la même espèce ont identifié différents critères associés à l’efficacité, et les améliorations rapportées pour une espèce (par exemple, le GG en 3′ rapporté pour Caenorhabditis elegans) attendent encore une validation plus poussée dans le même système et dans d’autres systèmes. Pour les applications de CRISPRa et CRISPRi, les chercheurs tentent de définir des règles de conception non seulement en fonction de la séquence de l’ARN guide, mais également du nombre et de la position des ARN guides par rapport aux caractéristiques spécifiques annotées du gène cible. Pour CRISPRa, deux études ont montré que l’activation est maximisée lorsque les ARN guides se trouvent dans une fenêtre de -400 à -50 pb en amont du site de démarrage de la transcription (TSS) [^19^, ^20^]. En revanche, le silence génique induit par CRISPRi semble être le plus efficace lorsque les ARN guides ciblent de -50 à +300 pb à partir du TSS, et lorsque les ARN guides ne ciblent pas une portion d’ADN liée à des nucléosomes [^19^, ^21^]. Pour CRISPRi, il semble y avoir des exigences différentes chez les procaryotes et les eucaryotes : bien que CRISPRi chez Escherichia coli nécessite que les ARN guides ciblent le brin non transcrit (aussi appelé brin sens), des études ultérieures dans les cellules eucaryotes ont montré que les ARN guides se liant à l’un ou l’autre brin peuvent fonctionner [^4^, ^23^, ^24^]. Les chercheurs testent actuellement l’impact de la séquence des ARN guides, de leur position par rapport aux sites de démarrage de la transcription ou de la traduction, et des protéines Cas9 ou des protéines de fusion Cas9 de rechange, dans le but de trouver les paramètres optimaux pour l’activation ou l’inhibition ciblée et robuste. Les effets hors-cibles sont probablement moins préoccupants que pour les approches de coupure CRISPR en raison de la gamme limitée de sites de liaison efficaces par rapport au promoteur cible. Autrement dit, même si la liaison se produit sur des sites hors-cibles, il est peu probable que cela se produise à une distance suffisamment proche du promoteur pour avoir un effet significatif sur l’expression génique.
Il est intéressant de noter qu’un ensemble récemment publié de règles de conception qui améliorent considérablement l’efficacité des ARN guides pour l’activité de coupure de Cas9 et pour CRISPRi n’a pas réussi à prédire l’efficacité des ARN guides pour CRISPRa. Cela suggère que des principes de conception distincts peuvent être nécessaires pour ces deux approches. De plus, étant donné que l’efficacité de CRISPRa est inversement corrélée au niveau d’expression basal d’un gène donné (c’est-à-dire que CRISPRa est plus efficace pour les gènes exprimés à faible niveau), les chercheurs doivent garder à l’esprit que même lors de l’utilisation d’un ARN guide par ailleurs efficace pour activer un gène d’intérêt, un niveau d’expression basal élevé limitera probablement l’impact que CRISPRa peut avoir. Dans l’ensemble, il reste à voir dans quelle mesure des règles générales émergeront pour les différentes approches de CRISPR, dans quelle mesure les paramètres optimaux seront spécifiques à une espèce, à un tissu ou à un type cellulaire particulier, dans lesquels des facteurs endogènes pourraient être pertinents pour la spécificité et/ou l’efficacité, et dans quelle mesure les paramètres optimaux seront spécifiques à une méthode de délivrance donnée (transfection, transduction, etc.), par exemple, car les étapes limitantes de vitesse pourraient être différentes pour différentes méthodes de délivrance.
L’utilisation de CRISPR a connu un développement rapide au fil des années, et les chercheurs ont élaboré des règles et des algorithmes pour prédire certaines propriétés spécifiques, comme les risques de hors-cibles ou l’efficacité maximale. Ces règles de hors-cibles ont été empruntées aux approches déjà développées pour limiter les hors-cibles basées sur les séquences d’ARN interférents ou garantir une spécificité des amorces. La plupart des algorithmes de prédiction de hors-cibles pour CRISPR se basent sur la définition de séquences génomiques similaires à la séquence cible, et utilisent ensuite une limite définie par l’utilisateur pour le nombre de bases non appariées qui empêcheraient une mutation. Cependant, il reste encore des incertitudes quant au nombre de non appariements nécessaires pour empêcher une mutation d’un site hors-cible, et cela peut varier d’un système à l’autre. De plus, il est possible que même les séquences hors-cibles qui ne sont pas des correspondances parfaites, c’est-à-dire avec une discontinuité dans la séquence créant un écart ou une boucle, puissent être des sites cibles valides, même si la plupart des algorithmes actuels ne les évaluent pas. Plusieurs approches impartiales ont été développées pour détecter les coupures hors-cibles par CRISPR, bien qu’il ne soit généralement pas possible de les appliquer pour chaque ARN guide utilisé. Néanmoins, l’étendue des hors-cibles, ainsi que leur importance différente dans des approches telles que CRISPRa et CRISPRi par rapport à la génération de knockouts par NHEJ, suggèrent que des hors-cibles supplémentaires spécifiques à chaque approche restent une préoccupation. Des revues récentes traitant des hors-cibles et de leur détection sont disponibles pour des informations plus détaillées [^14^, ^15^, ^16^, ^17^].
Certaines règles pour l’efficacité des ARN guides ne semblent pas toujours être généralisables pour différentes applications de Cas9, ou pour la même application dans différentes espèces. Même les groupes travaillant sur la même espèce ont identifié différents critères associés à l’efficacité, et les améliorations rapportées pour une espèce (par exemple, le GG en 3′ rapporté pour Caenorhabditis elegans) attendent encore une validation plus poussée dans le même système et dans d’autres systèmes. Pour les applications de CRISPRa et CRISPRi, les chercheurs tentent de définir des règles de conception non seulement en fonction de la séquence de l’ARN guide, mais également du nombre et de la position des ARN guides par rapport aux caractéristiques spécifiques annotées du gène cible. Pour CRISPRa, deux études ont montré que l’activation est maximisée lorsque les ARN guides se trouvent dans une fenêtre de -400 à -50 pb en amont du site de démarrage de la transcription (TSS) [^19^, ^20^]. En revanche, le silence génique induit par CRISPRi semble être le plus efficace lorsque les ARN guides ciblent de -50 à +300 pb à partir du TSS, et lorsque les ARN guides ne ciblent pas une portion d’ADN liée à des nucléosomes [^19^, ^21^]. Pour CRISPRi, il semble y avoir des exigences différentes chez les procaryotes et les eucaryotes : bien que CRISPRi chez Escherichia coli nécessite que les ARN guides ciblent le brin non transcrit (aussi appelé brin sens), des études ultérieures dans les cellules eucaryotes ont montré que les ARN guides se liant à l’un ou l’autre brin peuvent fonctionner [^4^, ^23^, ^24^]. Les chercheurs testent actuellement l’impact de la séquence des ARN guides, de leur position par rapport aux sites de démarrage de la transcription ou de la traduction, et des protéines Cas9 ou des protéines de fusion Cas9 de rechange, dans le but de trouver les paramètres optimaux pour l’activation ou l’inhibition ciblée et robuste. Les effets hors-cibles sont probablement moins préoccupants que pour les approches de coupure CRISPR en raison de la gamme limitée de sites de liaison efficaces par rapport au promoteur cible. Autrement dit, même si la liaison se produit sur des sites hors-cibles, il est peu probable que cela se produise à une distance suffisamment proche du promoteur pour avoir un effet significatif sur l’expression génique.
Il est intéressant de noter qu’un ensemble récemment publié de règles de conception qui améliorent considérablement l’efficacité des ARN guides pour l’activité de coupure de Cas9 et pour CRISPRi n’a pas réussi à prédire l’efficacité des ARN guides pour CRISPRa. Cela suggère que des principes de conception distincts peuvent être nécessaires pour ces deux approches. De plus, étant donné que l’efficacité de CRISPRa est inversement corrélée au niveau d’expression basal d’un gène donné (c’est-à-dire que CRISPRa est plus efficace pour les gènes exprimés à faible niveau), les chercheurs doivent garder à l’esprit que même lors de l’utilisation d’un ARN guide par ailleurs efficace pour activer un gène d’intérêt, un niveau d’expression basal élevé limitera probablement l’impact que CRISPRa peut avoir. Dans l’ensemble, il reste à voir dans quelle mesure des règles générales émergeront pour les différentes approches de CRISPR, dans quelle mesure les paramètres optimaux seront spécifiques à une espèce, à un tissu ou à un type cellulaire particulier, dans lesquels des facteurs endogènes pourraient être pertinents pour la spécificité et/ou l’efficacité, et dans quelle mesure les paramètres optimaux seront spécifiques à une méthode de délivrance donnée (transfection, transduction, etc.), par exemple, car les étapes limitantes de vitesse pourraient être différentes pour différentes méthodes de délivrance.
L’utilisation de CRISPR a connu un développement rapide au fil des années, et les chercheurs ont élaboré des règles et des algorithmes pour prédire certaines propriétés spécifiques, comme les risques de hors-cibles ou l’efficacité maximale. Ces règles de hors-cibles ont été empruntées aux approches déjà développées pour limiter les hors-cibles basées sur les séquences d’ARN interférents ou garantir une spécificité des amorces. La plupart des algorithmes de prédiction de hors-cibles pour CRISPR se basent sur la définition de séquences génomiques similaires à la séquence cible, et utilisent ensuite une limite définie par l’utilisateur pour le nombre de bases non appariées qui empêcheraient une mutation. Cependant, il reste encore des incertitudes quant au nombre de non appariements nécessaires pour empêcher une mutation d’un site hors-cible, et cela peut varier d’un système à l’autre. De plus, il est possible que même les séquences hors-cibles qui ne sont pas des correspondances parfaites, c’est-à-dire avec une discontinuité dans la séquence créant un écart ou une boucle, puissent être des sites cibles valides, même si la plupart des algorithmes actuels ne les évaluent pas. Plusieurs approches impartiales ont été développées pour détecter les coupures hors-cibles par CRISPR, bien qu’il ne soit généralement pas possible de les appliquer pour chaque ARN guide utilisé. Néanmoins, l’étendue des hors-cibles, ainsi que leur importance différente dans des approches telles que CRISPRa et CRISPRi par rapport à la génération de knockouts par NHEJ, suggèrent que des hors-cibles supplémentaires spécifiques à chaque approche restent une préoccupation. Des revues récentes traitant des hors-cibles et de leur détection sont disponibles pour des informations plus détaillées [^14^, ^15^, ^16^, ^17^].
Certaines règles pour l’efficacité des ARN guides ne semblent pas toujours être généralisables pour différentes applications de Cas9, ou pour la même application dans différentes espèces. Même les groupes travaillant sur la même espèce ont identifié différents critères associés à l’efficacité, et les améliorations rapportées pour une espèce (par exemple, le GG en 3′ rapporté pour Caenorhabditis elegans) attendent encore une validation plus poussée dans le même système et dans d’autres systèmes. Pour les applications de CRISPRa et CRISPRi, les chercheurs tentent de définir des règles de conception non seulement en fonction de la séquence de l’ARN guide, mais également du nombre et de la position des ARN guides par rapport aux caractéristiques spécifiques annotées du gène cible. Pour CRISPRa, deux études ont montré que l’activation est maximisée lorsque les ARN guides se trouvent dans une fenêtre de -400 à -50 pb en amont du site de démarrage de la transcription (TSS) [^19^, ^20^]. En revanche, le silence génique induit par CRISPRi semble être le plus efficace lorsque les ARN guides ciblent de -50 à +300 pb à partir du TSS, et lorsque les ARN guides ne ciblent pas une portion d’ADN liée à des nucléosomes [^19^, ^21^]. Pour CRISPRi, il semble y avoir des exigences différentes chez les procaryotes et les eucaryotes : bien que CRISPRi chez Escherichia coli nécessite que les ARN guides ciblent le brin non transcrit (aussi appelé brin sens), des études ultérieures dans les cellules eucaryotes ont montré que les ARN guides se liant à l’un ou l’autre brin peuvent fonctionner [^4^, ^23^, ^24^]. Les chercheurs testent actuellement l’impact de la séquence des ARN guides, de leur position par rapport aux sites de démarrage de la transcription ou de la traduction, et des protéines Cas9 ou des protéines de fusion Cas9 de rechange, dans le but de trouver les paramètres optimaux pour l’activation ou l’inhibition ciblée et robuste. Les effets hors-cibles sont probablement moins préoccupants que pour les approches de coupure CRISPR en raison de la gamme limitée de sites de liaison efficaces par rapport au promoteur cible. Autrement dit, même si la liaison se produit sur des sites hors-cibles, il est peu probable que cela se produise à une distance suffisamment proche du promoteur pour avoir un effet significatif sur l’expression génique.
Il est intéressant de noter qu’un ensemble récemment publié de règles de conception qui améliorent considérablement l’efficacité des ARN guides pour l’activité de coupure de Cas9 et pour CRISPRi n’a pas réussi à prédire l’efficacité des ARN guides pour CRISPRa. Cela suggère que des principes de conception distincts peuvent être nécessaires pour ces deux approches. De plus, étant donné que l’efficacité de CRISPRa est inversement corrélée au niveau d’expression basal d’un gène donné (c’est-à-dire que CRISPRa est plus efficace pour les gènes exprimés à faible niveau), les chercheurs doivent garder à l’esprit que même lors de l’utilisation d’un ARN guide par ailleurs efficace pour activer un gène d’intérêt, un niveau d’expression basal élevé limitera probablement l’impact que CRISPRa peut avoir. Dans l’ensemble, il reste à voir dans quelle mesure des règles générales émergeront pour les différentes approches de CRISPR, dans quelle mesure les paramètres optimaux seront spécifiques à une espèce, à un tissu ou à un type cellulaire particulier, dans lesquels des facteurs endogènes pourraient être pertinents pour la spécificité et/ou l’efficacité, et dans quelle mesure les paramètres optimaux seront spécifiques à une méthode de délivrance donnée (transfection, transduction, etc.), par exemple, car les étapes limitantes de vitesse pourraient être différentes pour différentes méthodes de délivrance.
